Στο γονιδίωμα όλων των ζωντανών οργανισμών υπάρχουν γονίδια που μεταγράφονται και δίνουν μεγάλα μόρια RNA τα οποία –μέχρι σχετικά πρόσφατα- θεωρείτο ότι δεν κωδικοποιούν πρωτεΐνη και δρουν απλά ως ρυθμιστικοί παράγοντες. Τα μόρια αυτά είναι γνωστά ως Long (ή Large) non Coding RNAs –lncRNAs για συντομία. Ωστόσο η πληθώρα διαδικασιών στις οποίες συμμετέχουν και τις οποίες ρυθμίζουν τα μεγάλα αυτά RNAs οδήγησε τους επιστήμονες να σκεφτούν.. «Μήπως τελικά τα non-coding RNAs δεν είναι και τόσο “non-coding”»…
Η αρχή…
Το 2002 μια ομάδα ερευνητών του Max Planck Institute for Plant Breeding Research ανακάλυψε ότι ένα lncRNA μήκους 679 νουκλεοτιδίων που προκύπτει από μεταγραφή του γονιδίου ENOD40, το οποίο πίστευαν ότι δεν κωδικοποιούσε τίποτα, τελικά κωδικοποιεί πρωτεΐνες δρώντας ως κανονικό messenger RNA (mRNA). Το RNA αυτό περιέχει μικρά ανοιχτά πλαίσια ανάγνωσης (δηλαδή τις αλληλουχίες που κωδικοποιούν τις πρωτεΐνες) τα οποία –ακριβώς επειδή είναι μικρά- είχαν ως τότε παραβλεφθεί. Εν τέλει διαπιστώθηκε από τους επιστήμονες ότι το μόριο αυτό κωδικοποιεί μικρά πεπτίδια των 12 και 24 αμινοξέων, τα οποία αλληλεπιδρούσαν με ένα ένζυμο σύνθεσης της σουκρόζης στα όσπρια.
Πέντε χρόνια αργότερα άλλο ένα θεωρούμενο long non coding RNA που τελικά κωδικοποιεί πρωτεΐνες εντοπίστηκε στη μύγα Drosophila. Βρέθηκε από την ομάδα του Yuji Kageyama ο οποίος τότε βρισκόταν στο National Institute for Basic Biology , στο Οκαζάκι της Ιαπωνίας. . Στις μύγες που δεν έφεραν το συγκεκριμένο RNA απουσίαζε ένας συγκεκριμένος φαινότυπος και έτσι οι ερευνητές οδηγήθηκαν στο συμπέρασμα ότι τελικά το RNA κωδικοποιεί πρωτεΐνη. Συγκεκριμένα βρήκαν ότι κωδικοποιούσε 4 μικρά πεπτίδια, 3 των 11 αμινοξέων και 1 των 32 αμινοξέων τα οποία ενεργοποιούν έναν σημαντικό μεταγραφικό παράγοντα.
Η συνέχεια… και οι δυσκολίες…
Από τότε πολλά ακόμη Long non-coding RNAs έχουν «μετονομασθεί» σε mRNAs αφού έχει βρεθεί ότι περιέχουν μικρά πλαίσια ανάγνωσης (<300 νουκλεοτίδια) άρα κωδικοποιούν μικρά πεπτίδια! Αυτά τα «μικρά μυστικά πεπτίδια» -που ως τώρα μας ήταν άγνωστα- έχουν αρχίσει να κυνηγούν οι επιστήμονες. Αν αναρωτηθούμε γιατί ως τώρα δεν τα είχαμε βρει, η απάντηση κρύβεται στα εργαλεία με τα οποία αναζητούσαμε ως τώρα τις κωδικοποιούσες αλληλουχίες.
Όταν αλληλουχήθηκαν πλήρως τα γονιδιώματα διαφόρων ειδών –από τα μέσα της δεκαετίας του 1990 ως και την αρχή του 21ου αιώνα- οι επιστήμονες άρχισαν να αναζητούν, μέσα στο χάος των δισεκατομμυρίων νουκλεοτιδιών των γονιδιωμάτων, τις κωδικοποιούσες αλληλουχίες (εξώνια) αλλά και τις ρυθμιστικές αλληλουχίες (πχ υποκινητές) θέτοντας αναγκαστικά συγκεκριμένα υπολογιστικά κριτήρια γι’ αυτό το σκοπό (πχ ένα ανοιχτό πλαίσιο ανάγνωσης πρέπει να αποτελείται από πάνω από 300 νουκλεοτίδια καθώς με βάση τις πιθανότητες όσο μεγαλύτερο είναι τόσο πιο πιθανό να κωδικοποιεί πρωτεΐνη). «Έτσι τα διάφορα πλαίσια ανάγνωσης που υπήρχαν φιλτράρονταν με αυτή τη λογική και αυτό επέτρεπε να ξεφορτωνόμαστε τα “σκουπίδια” δηλαδή το DNA που θεωρούσαμε ότι δεν κωδικοποιεί τίποτα» δηλώνει ο Eric Olson από το Southwestern Medical Center του Πανεπιστημίου του Τέξας . Αλλά η φύση μας διαψεύδει!…
«Προφανώς ήταν εν γνώσει των επιστημόνων ότι με τον τρόπο αυτό χάνονται πολύτιμες πληροφορίες καθώς υπάρχουν πάρα πολλά πλαίσια ανάγνωσης –μικρότερα των 300 νουκλεοτιδίων- που κωδικοποιούν λειτουργικές πρωτεΐνες» λέει ο Nicholas Ingolia από το Berkeley της California.
Τα μικρά πλαίσια ανάγνωσης που κρύβονται μέσα στα μεγάλα RNAs σε διάφορους οργανισμούς όπως η μύγα, το ποντίκι και το ψάρι είναι πιο εύκολο να «χαθούν» και για έναν ακόμη λόγο. Λόγω του μικρού τους μεγέθους είναι λιγότερο ευαίσθητα στην τυχαία μεταλλαξογένεση που εφαρμόζουν οι επιστήμονες προκειμένου να εντοπίσουν λειτουργικά mRNAs. Άρα είναι πιο δύσκολο να αποκαλυφθούν οι λειτουργίες τους. Επίσης –όπως σημειώνει η Andrea Pauli – τα μικρά πεπτίδια είναι δύσκολο να ανιχνευθούν και να ταυτοποιηθούν σε πολλούς οργανισμούς και επομένως είναι δύσκολο να πει κανείς αν είναι όντως εξελικτικά συντηρημένες πρωτεΐνες.
Λόγω τους πολύ μικρού τους μεγέθους, τα πεπτίδια είναι δύσκολο να ανιχνευθούν με τις υπάρχουσες τεχνικές (ηλεκτροφόρηση και κλασσική φασματομετρία μάζας) ωστόσο η έρευνα προχωρά και ανακαλύπτονται διαρκώς νέα πεπτίδια, όπως το “Toddler” που ανακάλυψε η Andrea Pauli και σχετίζεται με την ανάπτυξη του εμβρύου του Zebra fish. Τα Long non coding RNAs, που τελικά αποδεικνύονται coding, εντοπίζονται σε διάφορους ιστούς, όπως στην καρδιά, τους μύες και τον νευρικό ιστό και συμμετέχουν ενεργά σε καίριες λειτουργίες –όπως η ρύθμιση της λειτουργίας της αντλίας ασβεστίου που ευθύνεται για τη μυϊκή σύσπαση!
Τα τελευταία χρόνια πολλές ερευνητικές ομάδες ασχολούνται με τα μεγάλα αυτά RNAs και έχουν αναπτύξει τεχνικές τελευταίας τεχνολογίας αλλά και νέες υπολογιστικές μεθόδους προκειμένου να καθίσταται δυνατή η ανίχνευσή τους και ο χαρακτηρισμός τους. Τέτοιες τεχνικές αποτελούν η αλληλούχηση του RNA (RNA sequencing) και τα ριβοσωμικά αποτυπώματα (Ribosome footprinting/Ribosome profiling) που επιτρέπουν την ευαίσθητη ανίχνευση των σημείων που προσδένονται τα ριβοσώματα πάνω σε ένα RNA και άρα μας επιτρέπουν να συμπεράνουμε κατά πόσο το RNA αυτό μεταφράζεται σε πρωτεΐνη. Σε ό,τι αφορά το χαρακτηρισμό των πεπτιδίων που προκύπτουν, έχουν αναπτυχθεί νέα ευαίσθητα πρωτόκολλα φασματομετρίας μάζας που επιτρέπουν την ανίχνευση πολύ μικρών πεπτιδίων και το χαρακτηρισμό τους.
Όπως μας αποκαλύπτουν εδώ και πάνω από μια δεκαετία πολλές ερευνητικές ομάδες ανά τον κόσμο, υπάρχουν πολλά μικρά και μεγάλα μυστικά μέσα στο DNA μας που δε φανταζόμασταν. Όσο προχωρούν οι έρευνες κάθε μέρα θα ανακαλύπτουμε και κάτι καινούργιο που θα αποτελεί ένα ακόμα μικρό κομματάκι στο μεγάλο παζλ της ύπαρξής μας…
